Биологи из США нашли белок, который может защитить цитрусовые деревья от инфекционного заболевания — позеленения цитрусовых. Описанное соединение оказалось эффективней антибиотика стрептомицина и к тому же устойчивым к жаре, что делает его идеальным кандидатом для борьбы с патогенными бактериями.
Позеленение цитрусовых, или «болезнь желтого дракона», изначально родом из Азии, но уже не один десяток лет поражает деревья в Африке и Западном Полушарии. Это инфекционное заболевание цитрусовых деревьев передается от растения к растению через насекомых (Diaphorina citri). Возбудители болезни – бактерии рода Candidatus Liberibacter asiaticus (CLas). Среди всех заболеваний цитрусовых болезнь желтого дракона выделяется как наносящее самый большой ущерб плантациям. Распространенные симптомы включают в себя раннее пожелтение и опадение листьев, отмирание веток, внесезонное цветение и созревание маленьких, неправильной формы, с толстой зеленой кожурой и кислым вкусом плодов.
Для борьбы с болезнью сейчас используют инсектициды, чтобы контролировать переносчиков заболевания, и антибиотики, чтобы ограничить рост бактерий-возбудителей. Однако ни один из методов не показал себя достаточно эффективным в сдерживании заболевания. Специалисты возлагают надежды на врожденный иммунитет растений: обычно при встрече с инфекцией защитная система растений вырабатывает антимикробные белки. Известно, что все выращиваемые к употреблению цитрусовые подвержены позеленению, но существуют гибриды, которые устойчивы к воздействию CLas. Вероятно, устойчивые к заболеванию растения как раз выделяют антимикробные пептиды, которые борются с патогенными бактериями.
Группа исследователей из Калифорнийского университета под руководством Хайлин Цзиня (Hailing Jin) сравнила матричные РНК устойчивых и подверженных позеленению деревьев и определила список генов, которые могли отвечать за защиту растений от CLas. Среди них внимание ученых привлек ген, кодирующий небольшой белок из 67 аминокислотных остатков. По предсказанной структуре белок был похож на устойчивый к высоким температурам антимикробный пептид, который встречается у растений рода Arabidopsis. Схожие гены встречались у родственных устойчивых цитрусовых, например, у австралийского Пальчикового лайма (Microcitrus australasica), понцируса трехлисточкового (Poncirus trifoliata) или Муррайи метельчатой (Murraya paniculata). У культивируемых апельсинов (Citrus sinensis) и клементинов (Citrus clementine), которые плохо переносят заболевание, подобные гены были длиннее и экспрессировались менее активно.
Исследователи также проверили, присутствуют ли предполагаемые антимикробные пептиды во флоэме, проводящей ткани растений, где обычно концентрируются бактерии-возбудители заболевания. Белки нашлись во флоэме пальчикового лайма и понцируса, во флоэме апельсинов их замечено не было. Вместе эти результаты дали понять, что антимикробные пептиды скорее всего отвечают за устойчивость цитрусовых к поражению бактериями CLas.
Чтобы проверить эффективность антимикробных пептидов, ученые использовали созданную ранее модель, имитирующую заражение в природе: насекомые с положительным тестом на присутствие патогенных бактерий питались растением, и вместе со слюной насекомых бактерии попадали в растение. В модели использовали листоблошку Bactericera cockerelli и молодые растения Nicotiana benthamiana, родственные табаку. Листоблошка обычно не питается табаком, но иногда кусает его молодые побеги. Табак, в свою очередь, обычно не подвержен позеленению, но его молодые ростки немного желтеют в случае инфекции бактериями Candidatus Liberibacter. Его выбрали из-за того, что цитрусовые растут медленно и проявляют симптомы долго, а табак — значительно быстрее. Чтобы быстро оценить степень заражения и влияние антимикробных пептидов на бактерии в этой модели используют Bactericera cockerelli и Nicotiana benthamiana вместо Diaphorina citri и цитрусовых. Затем растения обрабатывали антимикробными пептидами, полученными из разных устойчивых деревьев. Подавить рост бактерий в растениях лучше всего удалось антимикробным пептидам из пальчикового лайма. Именно с этим белком и провели дальнейшие эксперименты.
Антибактериальный эффект пептида проверяли на бактерии Liberibacter crescens, которую, в отличие от CLas, можно культивировать в лабораторных условиях. Ученым удалось выяснить, что десять микромоль антимикробного пептида убивает бактерии уже через полчаса воздействия, а дозы поменьше (один микромоль и сто наномоль) показывают подобный результат спустя пять часов. 100 наномоль вещества даже оказались более эффективными против бактерий, чем 172 микромоль антибиотика стрептомицина. К приятному удивлению авторов работы, описанный ими антимикробный пептид оказался устойчивым к относительно высоким температурам. Белок нагревали до 60 градусов Цельсия и держали в таком состоянии 20 часов, после этого снова проверяли его активность. Большую часть бактерицидного эффекта пептид сохранил, в отличие от стрептомицина.
Исследователи также определили оптимальный промежуток между инъекциями раствора антимикробного пептида. Больные растения, которые раз в два месяца получали раствор с концентрацией 100 микромоль, стали выглядеть здоровыми, а титр патогенных бактерий в их флоэме значительно снижался. Деревья из контрольной группы, которые не получали лечения, хуже росли и не теряли характерное пожелтение листьев. Не менее важно, что антимикробный пептид запускал иммунный ответ и в здоровых растениях. Обработанные спреем деревья активировали экспрессию целого набора защитных генов. Вероятно, стимуляция собственного иммунитета растений может защитить их от многих патогенов, а не только от CLas.
Зараженные апельсиновые деревья (Citrus sinensis) спустя 12 месяцев обработки пустым раствором (слева) и раствором антимикробного пептида (справа)
Опыты с другими бактериями позволили предположить, что антимикробный белок эффективен в целом против бактерий класса альфабактерий, к которому и относятся Candidatus Liberibacter. Предположительно, описанный пептид разрушает внешнюю мембрану бактерий и разрушает клетку, что ведет к ее лизису.
Авторы оценили токсичность белка. Фитотоксичность раствора с концентрацией 100 микромоль оказалась незначительной. Для людей белок также не представляет опасности: он быстро расщепляется пепсином – ферментом, который вырабатывается в желудке. Кроме того, люди давно употребляют плоды пальчикового лайма в пищу, и содержащийся в них антимикробный пептид, по-видимому, легко переваривается. Ученые надеются, что описанное ими средство поможет агрономам и спасет плантации цитрусовых от болезни желтого дракона.
Антимикробные пептиды вырабатываются многими живыми организмами: грибами, растениями, животными. Ученые активно исследуют эти вещества, которые имеют потенциальное применение и в медицине. Кроме того, возможно, эти белки могут бороться не только с бактериями, но и вирусами. Например, антимикробный пептид из лягушачьей слизи может бороться с вирусом гриппа.